2022年AACR年度会议中，Michelle Monje等人关于CAR-T治疗H3K27M突变的弥漫性桥脑胶质瘤（Diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）和弥漫性中线胶质瘤（Diffuse midline gliomas，DMG）的研究获得了广泛的关注，而单细胞测序技术也在此项研究中发挥了重要作用。该论文于2022年2月7日在线发表于国际学术期刊《自然》。

CAR-T用于治疗H3K27M突变的DIPG/ DMG

CAR-T细胞治疗技术是目前广受关注的癌症前沿疗法，其原理为：人为给正常T细胞加入特定癌细胞表面抗原的受体，使T细胞能特异的和癌细胞结合，从而通过细胞杀伤作用来杀伤癌细胞。

CAR-T细胞治疗技术一经问世，首先在血液系统恶性肿瘤的治疗中发挥了极大的优势，截至到2022年3月末，已有6款CAR-T 产品中获 FDA 批准上市，NMPA也已批准2款CAR-T产品上市。目前针对实体瘤的CAR-T治疗也在快速开发中。

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H3K27M型DIPG/DMG是一种极具侵袭性的单发致命肿瘤，几乎没有治疗选择，平均预期寿命为诊断后10个月，5年生存率不到1%。

Michelle Monje团队在此前的研究中发现，双唾液神经节苷脂 (Disialogangliosid，GD2）在H3K27M突变的弥漫性中线胶质瘤细胞上高度表达，因此他们选定GD2作为DIPG/DMG潜在的CAR-T细胞治疗靶点，并在小鼠中进行了初步的探索。

在本研究中，研究人员先通过静脉注射1×10^6 Cells/Kg剂量GD2-CAR T 细胞的形式对多位DIPG/DMG患者进行了筛选，最终选定4名H3K27M突变型DIPG/DMG患者接受GD2-CAR T输注(3名DIPG患者，1名脊髓DMG患者 )，在脑室内给药。

a．MRI结果显示DIPG 3号患者肿瘤明显减小

b.DIPG 3号患者表现出明显的生理缓解

临床结果显示，4名患者中有3名在静脉注射GD2-CAR T细胞后获得了影像学和临床获益（一名脊髓DMG患者在CAR T细胞制备过程中出现了快速的肿瘤进展，因而从研究中移除），患者诊断后寿命明显延长，且患者在神经功能方面出现了明显的恢复现象。但是，GD2-CAR T细胞进入人体后经过了怎样的历程？GD2-CAR T细胞又与癌细胞、免疫细胞发生了怎样的相互作用？ 这些还需要更精细的研究方法来解答。

单细胞测序解析CAR-T技术治疗过程

为了更加深入地理解GD2-CAR T细胞输注后的起效机制，研究人员利用单细胞测序技术进行了进一步的分析研究。研究者取了4位患者不同治疗阶段的脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）样本，以及CAR T细胞制品中分离得到的CAR阳性、阴性T细胞，进行了单细胞RNA测序分析。实验完成25598个来自CSF，40000个来自CAR T细胞制品，共65598个细胞的RNA测序。

基于单细胞RNA测序分析后得到的CSF样本细胞图谱

基于RNA测序数据的CSF样本细胞图谱结果显示，CSF样本中除了淋巴细胞、髓样细胞、罕见星形胶质细胞和B细胞，还有一群双重谱系细胞（右上图，红色框框出），暗示患者体内可能存在髓样细胞吞噬T细胞的可能性。

单细胞转录组分析不同的骨髓细胞亚群

研究者针对给药后的CSF样本中髓系细胞，进一步进行了更细致的细胞图谱分析。结果发现，髓系细胞可分为7种不同的细胞群，包括表达各种功能特征的单核细胞、小胶质细胞和巨噬细胞，以及增殖的骨髓细胞。

不同治疗时间段CSF样本中髓系细胞比例

分析结果显示，在脑内室给药后的炎症峰值时间点上，出现了以干扰素应答为特征的髓系细胞，该细胞群显示出明显的免疫激活特征。相比之下，静脉注射和给药点晚期，脑脊液髓样细胞亚群表达了显著的吞噬作用和脂质代谢基因程序，这些细胞表现出强烈的免疫抑制特征。以上这些结果都为GD2-CAR T细胞治疗 H3K27M+ 突变型DIPG/DMG 的有效性提供了进一步的证据。

综上， 单细胞测序技术进一步从细胞层面和基因表达层面探究了GD2-CAR T 治疗H3K27M+ DIPG/DMG的过程，观察到了不同治疗阶段、不同给药途径、不同患者的异质性，对于理解GD2-CAR T发挥作用的机理和后续临床研究都有指导意义。

单细胞测序技术应用于实体瘤CAR-T的展望

当前利用CAR-T技术用于治疗胃癌、胰腺癌，结直肠癌，黑色素瘤、肝癌的各项研究正在如火如荼中进行。单细胞测序技术可用于探究输注前后CAR-T细胞的增殖与克隆情况，输注前后不同阶段机体各细胞基因表达的变化，输注前后机体各细胞类型与克隆、增殖和疗效间的关系，体内CAR-T细胞实际作用情况与机制等各细胞治疗环节。相信未来，单细胞测序技术必将在CAR-T等细胞治疗技术中发挥更多的作用。

参考文献

1 Majzner, R. G. et al. GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas. Nature. 603, 934–941 (2022).2 Mount, C. W. et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR Tcells in H3-K27M+ diffuse midline gliomas. Nat. Med. 24, 572–579 (2018).3 Cooney, T. et al. Contemporary survival endpoints: an International Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Registry study. Neuro-Oncol. 19, 1279–1280 (2017).