图1. 细菌单细胞转录组学面临的挑战^[1]

以上原因使得微生物的单细胞RNA测序技术及相关应用都进展缓慢，同时也限制了其商业化的进程。

但是这些挑战真的无法克服吗？是否有实现微生物单细胞RNA测序的方法呢？答案当然是有的！近年来，科学家们不断技术攻关，开发出了多种细菌单细胞RNA测序技术，如microSPLIT、BacDrop等，并发表在Science、Cell等顶尖期刊上。

1、microSPLIT技术^[2]

microSPLIT由华盛顿大学Georg Seelig教授团队发明，于2020年12月17日发表在Science期刊上。它是一种针对细菌的高通量scRNA-seq方法，该技术基于真核细胞的单细胞RNA测序技术SPLiT-seq^[3]发展而来，能够可靠地分析革兰氏阴性模式菌和革兰氏阳性模式菌的混合物，可以在单细胞水平上揭示转录异质性。

图2. microSPLIT技术

2、BacDrop技术^[4]

BacDrop由美国麻省理工学院哈佛博德研究所的Deborah T. Hung教授团队发明，于2023年1月27日在Cell期刊上。它是一种基于液滴的全基因组并行的大规模细菌scRNA-seq测序技术，通过使用多编码策略克服基于液滴的单细胞方法中每个微流体通道可加载细胞数量受限的问题，实现了比基于孔板方法更高的检测通量。

图3. BacDrop技术

从技术上看，microSPLIT和BacDrop两种技术都能够在较低双物种污染率的情况下将两种不同细菌的转录本信息很好地区分开，证明了单细菌RNA-seq可以跨越革兰氏阳性和革兰氏阴性物种。

从底层技术讲，孔板法需要较为繁琐的人力操作，稳定性较低且通量有限。而液滴微流控技术可以避免大量人力成本的投入，而且能够大幅提高细胞通量，一次可检测多个样本，是单细胞测序技术领域未来的发展方向。

2022年6月，墨卓生物CTO郑文山博士在Science期刊上发表“High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome”^[5]技术性长文。该技术利用液滴微流控技术，首次实现了高通量单细胞基因组学测序，推动微生物单细胞测序进入新阶段。

在此基础上，墨卓在微生物单细胞组学领域继续发力，突破各种技术难点，成功在MobiNova®-100高通量单细胞测序建库系统上，实现了细菌的高通量单细胞RNA测序，将细菌单细胞RNA测序的商业化进程又向前推进了一步。

墨卓细菌单细胞RNA测序技术路径：

墨卓细菌单细胞RNA测序技术适配自主研发的MobiNova®-100高通量单细胞建库系统，基于半随机引物原理，在对细胞进行固定、通透化、细胞壁裂解、gDNA去除等步骤后，在细胞内完成mRNA分子的捕获和第一轮预索引，随后对cDNA的3’端添加polyA尾巴，并在液滴内完成cDNA二链合成和第二轮索引条形码标记，然后通过NGS文库构建和测序即可获得单个微生物细胞的转录组信息。其基于半随机引物原理可对RNA分子全长进行无偏捕获，此外可以捕获包含lncRNA、CircleRNA在内的非编码RNA。

图4. 墨卓微生物单细胞RNA测序技术路径

目前墨卓已经完成大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的检测，并且都取得了良好的检测结果，充分验证了技术路径的可靠性和稳定性。而且，该方法的基因检出灵敏度高，单细胞中位基因数可达数百，高于文献报道的水平。

用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种物种进行的单细胞转录组实验数据表明，物种之间可以得到良好的分群结果，证明了方法学的有效性。

图6. 双物种细胞分群图

基于墨卓MobiNova®-100自动化仪器平台的微生物单细胞转录组测序技术的推出，能够有效辅助科研工作者进行微生物单细胞转录组层面的研究，为开展单细菌转录组相关检测应用提供更多助力。

小墨会继续密切跟进研发部动向，为大家汇报更多墨卓微生物单细胞转录组的最新进展，敬请期待哦~~

[1] Christina Homberger and others, Ushering in a new era of single-cell transcriptomics in bacteria. microLife, Volume 3(2022).

[2] Anna Kuchina et al. , Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding. Science371,eaba5257(2021).

[3] Rosenberg, A.B., Roco, C.M., Muscat, R.A., Kuchina, A., Seelig, G., et al. ,  Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science, 360:176-182 (2018).

[4] Ma, Peijun et al. , Bacterial droplet-based single-cell RNA-seq reveals antibiotic-associated heterogeneous cellular states. Cell, Volume 186, Issue 4, 877 - 891.e14 (2023).

[5]. Wenshan Zheng, Shijie Zhao，High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome. Science. 2022 Jun 3; 376(6597)