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转录组2＋3！墨卓平台推出单细胞全长转录组解决方案
网站编辑：墨卓生物 │ 发布时间：2023-08-15
近日，墨卓生物联合及智医学，基于Nanopore平台，推出单细胞全长转录组解决方案，实现高通量、低成本的单细胞全长序列分析。该方案为科研人员发现新的细胞类型、研究细胞发育和分化的过程，以及探索各种疾病的发生机制提供新的研究利器。
单细胞转录组作为“入门级”单细胞技术，可以帮助我们了解到细胞间异质性、识别细胞类型特异性基因等信息，通常是基于二代测序平台，采用短读长的RNA测序方法。虽然该方法可以定量描述基因表达水平，但无法精细区分基因不同异构体。
三代测序可以解决读长较短和无法获取全长转录本数据的局限性，通过二代测序＋三代测序联用的方法，可以获得单细胞转录本的全长序列并定位细胞亚群，实现基因突变、融合基因、拷贝数变异、非编码RNA和可变剪切等研究。单细胞水平全长转录本的定量和定性分析，能够为各类疾病发病原因及精准治疗提供更全面的信息。
在制备单细胞悬液过后，通过MobiNova®-100平台对单细胞mRNA进行捕获，经过反转录生成cDNA，利用同一份cDNA分成两部分，分别构建二代测序文库和三代测序文库。其中，墨卓优化了整体的实验流程，通过二、三代测序优势互补，可以获得更加精细的细胞聚类、细胞注释、mRNA全长序列及结构信息。
1. 细胞悬液制备
根据不同组织类型，选择合适的细胞悬液制备方案。
所制备的细胞悬液，需要符合以下条件：
l 细胞数目：大于1×105个
l 细胞活性：大于80%
l 细胞大小：小于40μm
l 无明显结团和碎片
2. 获得全长cDNA
在MobiNova®-100高通量单细胞建库系统上结合MobiCube®高通量单细胞3’转录组试剂完成单细胞捕获，并获得单细胞全长cDNA。
详细操作见《MobiCube®高通量单细胞 3' 转录组试剂用户手册》。
3. 二代建库测序及分析
a. 吸取一定量的cDNA，参考《MobiCube® 高通量单细胞 3' 转录组试剂用户手册》构建测序文库并测序；
b. 使用MobiVision®生信软件进行数据分析，软件使用方法见《MobiVision®高通量单细胞多组学生信分析软件使用教程》。
4. Nanopore建库测序及分析
a. 完成步骤3.a之后，保留100-200ng cDNA作为备份，吸取全部剩余cDNA（N ng），使用MobiCube 3’ 转录组建库试剂盒继续扩增M循环（循环数计算方式参考公式：N×2(M-2)=1500）；
b. 纯化后获得1.5-2μg cDNA（若cDNA总量不足1.5 μg，可继续补扩增），并进行Nanopore测序，建议测序量为100G/万细胞 ；
c. 使用MobibarCheck软件对Nanopore测序原始数据进行校正，软件下载链接和使用说明可点击文末阅读原文链接获取。
三代全长转录测序获得1.5-2万个基因的同时，转录本的种类可以达到5-8万种，平均每个基因有3-5条转录本
左图为转录本长度分布，右图为基因转录本条数
PSCA（前列腺干细胞抗原基因）在单细胞二代测序的上皮细胞亚群中是泛表达，并未在左侧的恶性上皮中特异性表达，但是，PSCA的一条转录本，却是在左侧的恶性上皮细胞亚群中特异性表达。
左图为二代测序PSCA基因表达，右图为该基因的转录本表达
在本次测试中，部分样品可以检测出约1万条融合序列，并均可以归类到具体亚群中，非常方便查看哪个亚群更容易发生融合基因事件。
融合基因在亚群分布比例统计和亚群映射
以上就是MobiCube® 3’ 单细胞全长转录组解决方案的实验流程介绍和部分实测数据展示。
单细胞全长转录组应用范围广泛，在识别细胞周期、肿瘤细胞异质性研究、鉴定罕见细胞类型、免疫细胞分型、干细胞分型、疾病分型等领域拥有极大的潜力，墨卓生物联合及智医学，在整个实验流程及数据分析环节的关键节点进行了全面系统地优化，最大程度保证实验稳定性及数据的高效利用，可以帮您从容应对日益深入的科研需求，紧跟科研热点，从多个维度解析潜在的生物学信息。
阅读原文：https://www.mobidrop.com/bioinformatics-analysis-software/mobi-bioinfo-toolkit
创新驱动、卓鉴未来，墨卓生物创立于美国波士顿，落地中国浙江，汇集了由国际一流科学家和跨国医疗器械公司高管等组成的一批优秀人才。墨卓致力于用创新微流控和单细胞测序技术赋能科学研究与精准医疗。目前已经成为拥有微流控、测序、生化、硬件开发、生信等关键技术，推出单细胞测序与数字PCR双技术平台，在液体活检、伴随诊断、生命科学研究等多领域并行发展的科研+IVD解决方案领跑者